1.1.1.抗菌药物储存液制备 抗菌药物储存液浓度不该低于1000μg/ml(如1280μg/ml)或10倍于最高测定浓度。溶解度低的抗菌药物可稍低于上述浓度。抗菌药物直接购自厂商或相关组织。所需抗菌药物溶液量或粉剂量可公式进行核算。例如：需制作100 ml浓度为1280μg/ml的抗生素储存液，所用抗生素为粉剂，其药物的有用能为750μg/mg。用分析天平准确称取抗生素粉剂的量为182.6 mg。依据公式核算所需稀释剂用量为：（182.6 mg×750μg/ml）/1280μg/ml=107.0ml，然后将182.6 mg抗生素粉剂溶解于107.0ml稀释剂中。制备抗菌药物储存液所用的溶剂和稀释剂见表5。制作好的抗菌药物储存液应储存于-60℃以下环境，保存期不超越6个月。

　　1.1.2.药敏实验用抗菌药物浓度规模 依据NCCLS抗菌药物灵敏性实验操作规范，药物浓度规模应包括耐药、中介和灵敏分界点值，特殊状况破例。

　　1.1.3. 培育基 NCCLS引荐运用Mueller-Hinton（MH）肉汤，pH7.2~7.4。需氧菌及兼性厌氧菌在此培育基中成长杰出。在测验葡萄球菌对苯唑西林的灵敏性时，应在肉汤中参加2%（W/V）氯化钠，按制作厂家的要求制作需要量的MH肉汤。嗜血杆菌属菌运用HTM肉汤，肺炎链球菌和其它链球菌运用含2%~5%溶解马血的MH肉汤。

　　1.1.4.接种物的制备 有2种办法制作接种物，一是细菌成长办法，用接种环挑取形状类似待检菌落3-5个，接种于4-5ml的水解酪蛋白（MH）肉汤中，35℃孵育2-6h。增菌后的对数成长期菌液用生理盐水或MH肉汤校对浓度至0.5麦氏比浊规范，约含1~2×108CFU/ml。二是直接菌落悬液制作法，对某些苛养菌，如流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌和链球菌及甲氧西林耐药的葡萄球菌等菌株，引荐直接取培育18~24h的菌落调配成0.5麦氏比浊规范的菌悬液。用MH肉汤将上述菌悬液进行1∶100稀释后备用。留意应在15分钟内接种完制作好的接种物，并取一份接种物在非挑选性琼脂平板上传代培育，以查看接种物纯度。

　　1.1.5.稀释抗菌药物的制备及菌液接种 取无菌试管（13×100mm）13支，排成一排，除第1管参加1.6mlMH肉汤外，其他每管参加MH肉汤1ml，在第1管参加抗菌药物原液（如1280μg/ml） 0.4ml混匀，然后汲取1ml至第2管，混匀后再汲取1ml至第3管，如此接连倍比稀释至第11管，并从第11管中汲取1ml弃去，第12管为不含药物的成长对照。此刻各管药物浓度依次为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/ml。然后在每管内参加上述制备好的接种物各1ml，使每管终究菌液浓度约为5×105CFU/ml。第1管至第11管药物浓度别离为128、64、32、16、8、4、2、1、05、0.25、0.125μg/ml。

　　1.1.6.孵育 将接种好的稀释管塞好塞子，置35℃一般空气孵箱中孵育16~20h；嗜血杆菌和链球菌在一般空气孵箱中孵育20~24h；对或许的耐甲氧西林葡萄球菌和耐万古霉素肠球菌应继续孵育满24h。

　　1.1.7.成果判别与解说 在读取和陈述所测验菌株的MIC前，应查看成长对看管的细菌成长状况是否杰出，一起还应查看接种物的传代培育状况以确认其是否污染，质控菌株的MIC值是否处于质控规模。以肉眼调查，药物最低浓度管无细菌成长者，即为受试菌的MIC。甲氧苄胺嘧啶或磺胺药物的肉汤稀释法结尾判别，与阳性成长对看管比较按捺80%细菌成长管药物浓度为受试菌MIC。

　　依据NCCLS引荐的分界点值规范，判别耐药（resistant, R）、灵敏(susceptible, S)或中介（intermediate, I）。S表明被测菌株所引起的感染能够用该抗菌药物的常用剂量医治有用，禁忌症在外。R指该菌不能被抗菌药物的常用剂量在组织液内或血液中所到达的浓度所按捺，或归于具有特定耐药机理（如β-内酰胺酶），所以临床医治作用欠安。I是指MIC挨近药物的血液或组织液浓度，效果低于灵敏菌。还表明被测菌株能够经过进步剂量（如β-内酰胺类药物）被按捺，或在药物生理性浓集的部位（如尿液）被按捺。别的，中介还作为“缓冲域”，以避免由细小的技能要素失控，所导致较大的过错解说。

　　1.2.2.MIC板制备 无菌操作，将倍比稀释后不同浓度的抗菌药物溶液别离加到灭菌的96孔聚苯乙烯板中，第1至第11孔加药液，每孔10μl，第12孔不加药作为成长对照，冰冻枯燥后密封，-20℃以下保存备用。

　　1.2.3.接种物制备 将用成长法或直接菌悬液法制备的浓度相当于0.5麦氏比浊规范的菌悬液，经MH肉汤1∶1000稀释后，向每孔中加100μl，密封后置35℃一般空气孵箱中，孵育16~20h判别成果。当实验嗜血杆菌属，链球菌属时，孵育时刻为20~24h，实验葡萄球菌和肠球菌对苯唑西林和万古霉素的药敏实验时孵育时刻有必要满24h。此刻，第1孔至第11孔药物浓度别离为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/ml。

　　1.2.4.成果判别 以在小孔内彻底按捺细菌成长的最低药物浓度为MIC。当阳性对照孔（即不含抗生素）内细菌显着成长实验才有含义。当在微量肉汤稀释法呈现单一的跳孔时，应记载按捺细菌成长的最高药物浓度。如呈现多处跳孔，则不该陈述成果，需重复实验。一般对革兰阴性杆菌而言，微量肉汤稀释法测得的MIC与常量肉汤稀释法测得的成果相同或低一个稀释度（1孔或2倍）。

　　2.琼脂稀释法 琼脂稀释法是将不同剂量的抗菌药物，参加消融并冷至50℃左右的定量MH琼脂中，制成含不同递减浓度抗菌药物的平板，接种受试菌，孵育后调查细菌成长状况，以按捺细菌成长的琼脂平板所含最低药物浓度为MIC。本法长处是可在一个平板上一起作多株菌MIC测定，成果牢靠，易发现污染菌；缺陷是制备含药琼脂平板费时吃力。

　　2.1.培育基制备 运用MH琼脂，按产品说明书进行制作，pH7.2~7.4。淋病奈瑟菌运用GC琼脂根底加1%添加剂；其它链球菌运用含5%（V/V）绵羊血的MH琼脂（当实验磺胺药时，运用溶解的马血）。

　　2.2.含药琼脂平板制备 依据实验设计，将已倍比稀释的不同浓度的抗菌药物别离参加已加热溶解，并在45~50℃水浴中平衡的MH琼脂中，充沛混匀倾倒灭菌平皿，琼脂厚度3~4mm。一般按1∶9份额制作药物琼脂平板，依据需要来挑选药物浓度规模。制作好的含药琼脂平板应装入密封塑料袋中，置2~8℃冰箱可储存5天。

　　2.3.接种物制备与接种 制备浓度相当于0.5麦氏规范比浊管的菌悬液，再1∶10稀释，以多点接种器汲取制备好菌液（约1~2μl）接种于琼脂平板外表，每点菌数约为104CFU，构成直径为5~8mm的菌斑。接种好后置35℃孵育16~20h（甲氧西林耐药葡萄球菌、万古霉素耐药肠球菌孵育时刻应满24h），调查成果。奈瑟菌属、链球菌属细菌置5%二氧化碳、幽门螺杆菌置微需氧环境中孵育。

　　2.4.成果判别 将平板置于暗色、无反光物体外表上判别实验结尾，以按捺细菌成长的最低药物浓度为MIC。在含甲氧苄胺嘧啶或磺胺琼脂平板上可见细微细菌成长，与成长对照比较按捺80%以上细菌成长的最低药物浓度作为结尾浓度。

　　假如呈现有2个以上菌落成善于含药浓度高于结尾水平的琼脂平板上，或低浓度药物琼脂平板上不长而高浓度药物琼脂平板上成长现象，则应查看培育物纯度或重复实验。

　　3.E实验（E-test） E实验是指浓度梯度琼脂分散实验，其原理根本同分散法，即浓度呈接连梯度的抗菌药物从塑料试条中向琼脂中分散，在试条周围抑菌浓度规模内受试菌的成长被按捺，然后构成通明的抑菌圈。E实验归纳了稀释法和分散法的原理和特色，一起还弥补了二者的一些缺乏，能够像稀释法相同直接定量测出抗菌药物对受试菌的MIC。

　　3.2.贴E实验条 同纸片分散法，E实验条的刻度面朝上，不得贴反，一旦触摸琼脂后不得再移动。直径150mm的平皿内可放置6根E实验试条，90mm者一般只能放置1根。

　　3.4.成果阅览 孵育后环绕试条可构成一个椭圆形的抑菌圈，在抑菌圈和试条的横切相交处试条上的读数刻度便是测定抗菌药物对受试菌的MIC。阅览时应留意的问题见供货商的产品说明书。